芯片
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芯片 xīnpiàn
如果把中央处理器CPU比喻为整个电脑系统的心脏，那么主板上的芯片组就是整个身体的躯干。对于主板而言，芯片组几乎决定了这块主板的功能，进而影响到整个电脑系统性能的发挥，芯片组是主板的灵魂。
是检测基因表达。但是将生物分子有序地放在芯片上检测生化标本的策略是具有广泛的应用领域，除了基因表达分析外，杂交为基础的分析已用于基因突变的检测、多态性分析、基因作图、进化研究和其它方面的应用，微阵列分析还可用于检测蛋白质与核酸、小分子物质及与其它蛋白质的结合，但这些领域的应用仍待发展。对基因组DNA进行杂交分析可以检测DNA编码区和非编码区单个碱基改变、确失和插入，DNA杂交分析还可用于对DNA进行定量，这对检测基因拷贝数和染色体的倍性是很重要的。
用于DNA分析的样品可从总基因组DNA或克隆片段中获得，通过酶的催化掺入带荧光的核苷酸，也可通过与荧光标记的引物配对进行PCR扩增获得荧光标记DNA样品，从DNA转录的RNA可用于检测克隆的DNA片段，RNA探针常从克隆的DNA中获得，利用RNA聚合酶掺入带荧光的核苷酸。
对RNA进行杂交分析可以检测样品中的基因是否表达，表达水平如何。在基因表达检测应用中，荧光标记的探针常常是通过反转录酶催化cDNA合成RNA，在这一过程中掺入荧光标记的核苷酸。用于检测基因表达的RNA探针还可通过RNA聚合酶线性扩增克隆的cDNA获得。在cDNA芯片的杂交实验中，杂交温度足以除DNA中的二级结构，完整的单链分子（300-3000nt）的混合物可以提供很强的杂交信号。对寡核苷酸芯片，杂交温度通常较低，强烈的杂交通常需要探针混合物中的分子降为较短的片段（50-100nt），用化学和酶学的方法可以改变核苷酸的大小。
不同于DNA和RNA分析，利用生物芯片进行蛋白质功能的研究仍有许多困难需要克服，其中一个难点就是由于许多蛋白质间的相互作用是发生在折叠的具有三维结构的多肽表面，不像核酸杂交反应只发生在线性序列间。芯片分析中对折叠蛋白质的需要仍难达到，有以下几个原因：第一，芯片制备中所用的方法必需仍能保持蛋白质灵敏的折叠性质，而芯片制备中所有的化学试剂、热处理、干燥等均将影响到芯片上蛋白质的性质；第二，折叠蛋白质间的相互作用对序列的依赖性更理强，序列依赖性使得反应动力学和分析定量复杂化；第三，高质量的荧光标记蛋白质探针的制备仍待进一步研究。这些原因加上其它的问题减慢了蛋白质芯片检测技术的研究。
自从1991年Fodor等人［1］提出DNA芯片的概念后，近年来以DNA芯片为代表的生物芯片技术［2～6］得到了迅猛发展，目前已有多种不同功用的芯片问世，而且，有的已经在生命科学研究中开始发挥重要作用.所谓的生物芯片即应用于生命科学和医学领域中作用类似于计算机芯片的器件.其加工制作采用了像集成电路制作过程中半导体光刻加工那样的缩微技术，将生命科学中许多不连续的过程如样品制备、化学反应和检测等步骤移植到芯片中并使其连续化和微型化，这与当年将数间房屋大小的分离元件计算机缩微到现在只有书本大小的笔记本计算机有异曲同工之效.这种基于微加工技术发展起来的生物芯片，可以把成千上万乃至几十万个生命信息集成在一个很小的芯片上，对基因、抗原和活体细胞等进行测试分析，用这些生物芯片所制作的各种不同用途的生化分析仪和传统仪器相比较具有体积小、重量轻、成本低、便于携带、防污染、分析过程自动化、分析速度快、所需样品和试剂少等诸多优点.目前生物芯片已不再局限于基因序列测定和功能分析这样的应用，新派生的一批技术包括：芯片免疫分析技术［7］、芯片核酸扩增技术［8～10］、芯片精虫选择和体外受精技术［11，12］，芯片细胞分析技术［13］和采用芯片作平台的高通量药物筛选技术［14］等.这类仪器的出现将为生命科学研究、疾病诊断和治疗、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品卫生监督、航空航天等领域带来一场革命.因此，美国总统克林顿在1998年1月的国情咨文演讲中指出：“在未来的12年内，基因芯片将为我们一生中的疾病预防指点迷津”.另外，美国商界权威刊物Fortune［15］对此作了如下阐述: “微处理器在本世纪使我们的经济结构发生了根本改变，给人类带来了巨大的财富，改变了我们的生活方式.然而，生物芯片给人类带来的影响可能会更大，它可能从根本上改变医学行为和我们的生活质量，从而改变世界的面貌”.由于生物芯片技术领域的飞速发展，美国科学促进协会于1998年底将生物芯片评为1998年的十大科技突破之一［16］.现在，生物芯片已被公认将会给下个世纪的生命科学和医学研究带来一场革命，并已成为各国学术界和工业界所瞩目并研究的一个热点.
生物芯片的制备主要依赖于微细加工、自动化及化学合成技术。 根据不同的使用要求，可以采用微加工技术在芯片的基底材料上加工出各种微细结构，然后再施加必要的生物化学物质并进行表面处理。而更为简单的芯片制备如DNA芯片的制备，则是在基底上利用自动化或化学合成方法直接施加或合成必要的生物化学物质，对基底材料并不做任何微细加工。通常比较典型的DNA芯片制备方法有4种。 第1种是Affymetrix公司开发的光引导原位合成法.该方法是微加工技术中光刻工艺与光化学合成法相结合的产物［17］。第2种方法是Incyte Pharmaceutical公司采用的化学喷射法。该方法是将合成好的寡核苷酸探针定点喷射到芯片上并加以固定化来制作DNA芯片。第3种方法是斯坦福大学研制的接触式点涂法，在DNA芯片制备中通过高速精密机械手的精确移动让移液头与玻璃芯片接触而将DNA探针涂敷在芯片上［18］。第4种方法是通过使用4支分别装有A，T，G，C核苷的压电喷头在芯片上并行合成出DNA探针［19］。不管何种方法，目的都是希望能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置上。
核酸样品的制备
分离和纯化核酸样品并不是一件容易的工作，它包括了细胞分离、破胞、脱蛋白、提取DNA等多方面的工作.在细胞分离方法上较突出的有过滤分离（如宾夕法尼亚大学研究小组开发的横坝式过滤芯片［20］）和介电电泳分离（利用施加在芯片上的高频非均匀电场在不同的细胞内诱导出偶电极，导致细胞受不同的介电力作用，从而把它们从样品中分离出来［21，22］）等.
生化反应
因为目前所用检测仪器的灵敏度还不够高，因此从血液或活体组织中提取的DNA在标记和应用前都需要扩增复制.例如，在对一个肿瘤的活体解剖样品进行检测时，需要在几千个正常基因中找到一个异常的癌基因，很显然这需要对样品DNA进行必要和特有的复制才易于检测.芯片中的核酸扩增研究目前已有了很大的进展，在芯片中进行PCR获得成功的有宾夕法尼亚大学研究小组［23］、美国加州Lawrence Livermore国家实验室［24］、Perkin-Elmer公司［25］和伦敦帝国理工大学［26］.宾夕法尼亚大学研究小组所做的扩增反应是在硅-玻璃芯片中进行的，芯片的外部加热和冷却采用的是计算机控制的Peltier电热器.他们成功地在硅-玻璃芯片中完成了一系列不同的核酸扩增反应，例如RT-PCR，LCR，多重PCR和DOP-PCR.Lawrence Livermore国家实验室加工的硅芯片采用了芯片内置式薄膜多晶硅加热套，使其升降温的速度可以得到极大的提高.Perkin-Elmer公司的PCR反应则是在塑料芯片上完成的.伦敦帝国理工大学Manz领导的研究小组研制了一种样品可在不同温度的恒温区间内连续流动的PCR芯片.
普通的PCR有一定的不足之处，如难以实现多重扩增以及在PCR过程中存在竞争等.Mosaic Technologies公司的研究人员研究出了固相PCR系统，他们将两个引物固化在丙烯酰胺薄膜上，并让其与DNA模板和PCR试剂接触，这样便可在固相表面进行PCR反应.扩增时所合成的DNA会在引物间形成桥，从而避免了竞争问题.该系统目前还处于研究阶段.在核酸样品制备中另一个革新的方法是Lynx Therapeutics公司研究的大规模并行固相克隆，该方法可以同时在样品中克隆出成百上千个单独的DNA片段.
检测方法
目前，常用的芯片检测方法有芯片毛细管电泳分离检测和亲和结合分析.芯片毛细管电泳是1983年由Dupont公司的Pace开发出来的.随后，瑞士的Ciba Geigy公司和加拿大的Alberta大学合作利用玻璃芯片毛细管电泳完成了对寡核苷酸的分离［27］.首次用芯片毛细管阵列电泳检测DNA突变和对DNA进行测序工作的是由加利福尼亚大学伯克利分校Mathies领导的研究小组完成的［28］.通过在芯片上加上高压直流电，他们在近2 min的时间内便完成了从118～1 353 bp的多条DNA片段的快速分离.宾夕法尼亚大学Wilding的小组与Ramsey的小组一道用芯片毛细管电泳对芯片中通过多重扩增得到的用于Duchenne-Becker肌萎缩诊断的若干DNA片段进行分离也获得了成功［29］.其他用芯片毛细管电泳检测突变的外国公司和学术机构有Perkin-Elmer公司、Caliper Technologies公司、Aclara Biosciences公司和麻省理工学院等.
对DNA芯片而言，亲和结合分析主要是通过核酸之间的杂交结合来进行的.杂交的复杂程度取决于芯片上探针的长度和被测DNA片段的长度以及DNA二级结构的稳定度.利用杂交可进行杂交重复测序［30，31］、DNA突变检测［31，32］和基因表达分析［33］.杂交重复测序的过程是：将含有与探针序列互补的单链DNA与其他DNA的混合物置于芯片上，固化的探针就会通过与其序列互补的DNA片段杂交而将其从很复杂的混合样品中识别出来，通过使用带有计算机的荧光检测系统对芯片上检测出来的DNA样品所发出的荧光强弱及各探针的已知序列进行分析、对照和组合就可以得知样品DNA所含的碱基序列.1996年Science对应用芯片杂交技术进行杂交重复测序作了报道，Chee等人［30］在一块固化有135 000个寡聚核苷酸探针（每个探针长度为25个核苷）的硅芯片上对长度为16.6 kb的整个人线粒体DNA进行了序列测定.每组探针之间的间隔为35 μm，重复测序精度为99%；此外通过对11个非洲人个体样品斑点进行分析，他们发现在这些样品中的线粒体DNA中所存在的突变多态性达505个.用生物芯片从事杂交测序的美国公司现有Affymetrix和Hyseq两家，Affymetrix还开发了一套系统（gene chip bioinformation system），将芯片测序与生物信息学联系在一起，测序结果直接进入数据库做下一步的分析.利用杂交分析DNA的一个重要应用是进行DNA突变检测，例如Hacia等人［32］采用由96 000个寡核苷酸探针所组成的杂交芯片，完成了对遗传性乳腺癌和卵巢肿瘤基因BRCA1中外显子上的24个异合突变点(单核苷突变多态性)的检测.他们通过引入参照信号和被检测信号之间的色差分析使得杂交的特异性和检测灵敏度获得了提高.用生物芯片做杂交突变检测的美国公司有Beckman，Abbot Laboratory，Affymetrix，Nanogen，Sarnoff，Genometrix，Vysis，Hyseq，Molecular Dynamics等； 英美学术机构有宾夕法尼亚大学，牛津大学，Naval Research，Whitehead Institute for Biomedical Research，Argonne国家实验室等.利用芯片杂交对基因表达进行分析研究是DNA芯片的另一个主要用途.一般来说，对基因表达进行研究需要相对较长的杂交时间，不需要准确地测序，而主要是了解基因中独特的Motifs结构.基因表达的分析研究给疾病诊断和药物筛选带来了巨大的冲击.Lockhart等人［34］采用固化有65 000个不同序列探针（长度为20个核苷）的芯片，定量地分析了一个小鼠T细胞中整个RNA群体中21个各不相同的信使RNA，这些专门设计的探针能与114个已知的小鼠基因杂交.分析结果发现，在诱发细胞分裂后另外20个信使RNA的表达也发生了改变.检测结果表明该系统对RNA的检出率为1:300 000，对信使RNA的定量基准为1:300.DeRisi等人［35］将一个恶性肿瘤细胞线中得到的1 161个不同的cDNA探针通过机械手“刷印”到载玻片上以观察癌基因的表达情况.在比较两个标有不同荧光标记的细胞信使RNA群的杂交结果之后，他们对引入正常人染色体后肿瘤基因受到抑制的细胞中的基因表达结果进行了分析.微阵列芯片不仅在基因分析上获得成功，研究人员更是将该技术与其他相关领域相结合，使得微阵列技术的应用更加广泛［36，37］.
对基因芯片的制作者和用户来说，在芯片上从事杂交目前所获得的结果并不是很完美的，存在着一些问题.首先，阵列上的杂交不是一个简单的液相反应，而是液-固反应，使得DNA链并不能在完全游离的情况下自然地杂交结合在一起；而且DNA的二级结构也会导致失真的杂交结果（链内杂交问题）.针对后一个问题，人们又研究出通过使用peptide nucleic acids（PNA）探针来解决链内杂交问题的新方案.在PNA-DNA杂交过程中，用PNA制作的探针比用DNA作的探针更容易接近DNA的目标序列.相比之下，PNA-DNA杂交结构比DNA-DNA杂交结构更稳定，所以对错配也就更易检测.让DNA在芯片表面富集是提高在芯片上DNA并行杂交速度的一个措施之一.Nanogen公司所开发的主动式电子生物芯片，可以使被检测的DNA/RNA分子以很快的速度接近被固化的DNA探针，从而使杂交速度得到极大的提高.
信息采集
目前，大多数的DNA芯片分析采用的是荧光检测.荧光检测重复性好，是目前研究人员广泛使用的一种方法.除此之外，还有飞行时间质谱仪、光波导、二极管阵列检测、直接电量变化检测等.例如，美国Sequenom公司采用光敏连接技术，将探针通过光敏基团连接在芯片上.当杂交结束后，利用激光切割释放寡聚核苷酸并用飞行时间质谱仪进行检测.该公司现在只能对较短的DNA片段进行分析，最终是否能实现对长序列DNA做分析还有待进一步努力.威斯康星大学的Smith等人最近也用PNA探针和飞行时间质谱仪分析了人体内酪氨酸酶基因的多态位点.不管是何种检测系统，都需要利用一些必要的仪器与软件，如扫描共聚焦显微镜可以在微米级的分辨率下检测芯片表面数以千计的探针杂交结果，很多公司也为芯片的分析开发了相应的软件，以便快速地对杂交数据进行处理和分析.除了上述通过杂交获得分析结果的微小阵列芯片以外，还有其他多种具有不同微结构（如微通道、反应腔、过滤器等等）的芯片正在研制和开发中，这些芯片的大小一般为1 cm2.生物芯片的研究在80年代就已开始，如杜邦公司研究的芯片毛细管电泳技术.目前，已开发的生物芯片种类越来越多，如毛细管电泳芯片、细胞分离芯片、免疫芯片、质谱分析芯片、核酸扩增芯片等，所有这些芯片的研究与开发为以后分析仪器的微型化和缩微芯片实验室的实现打下了良好的基础.
生物芯片的发展方向
与微加工技术朝纳米尺度发展一样，某些种类的生物芯片的研究也正在朝向纳米量级发展.研究人员发现一些天然分子或分子的生物自组装能力完全可以用于制作纳米器件.例如，用胶原质做导线，抗体做夹子，DNA做存储器，膜蛋白做泵等等.虽然目前尚无成功的纳米芯片出现.人们利用分子的自组装特性制作了一些结构，如直径为0.5 μm、长30 μm的脂质管；直径0.7 μm的圆形多肽纳米管和显微分子齿轮等.这些利用分子来设计和装配仪器零件类似物的研究，为纳米芯片的开发打下了良好的基础.
对生物芯片研究人员来说，最终的研究目标是对分析的全过程实现全集成，即制造微型全分析系统（micro total analytical systems）或缩微芯片实验室（laboratory-on-a-chip）.在芯片的功能集成方面，目前已有了一批成果.首先，美国Nanogen公司、Affymetrix公司、宾夕法尼亚大学医学院和密西根大学的科学家们通过利用在芯片上制作出的加热器、阀门、泵、微量分析器、电化学检测器或光电子学检测器等，将样品制备、化学反应和检测3部分作了部分集成，并在此基础上先后制作出了结构不同的缩微芯片实验室样机［38］.例如，Nanogen公司的科学家采用生物电子芯片在较短时间内先通过施加高频交流电场把微生物从人的血样中分离出来，然后用电脉冲进行破胞处理，最后对破胞后所得的脱氧核糖核酸进行片段化和杂交检测.该实验的成功是生物芯片研究领域的一大突破，它向人们展示了用生物芯片制作缩微实验室的可能性.
生物芯片技术另外一个重要、且具有很强应用价值的发展方向就是为新药的开发提供高通量乃至超高通量筛选的技术平台［14］.该项技术是将生物芯片技术所具有的高集成度与组合化学技术、受体结合分析及机器人自动化技术等相结合而产生的.组合化学是利用高分子载体快速同步合成先导物的类似物和衍生物的一种化学方法，它使过去的衍生物个体化合成方式发展成以串联和并联方式同步合成数以千计乃至数万个化合物的组合合成方式.反应后先对混合物进行分组筛选，然后根据生物活性再决定是否对个别化合物进行分离纯化.这种根据母体化合物结构快速合成化合物群体，其结构范围又可以预测的方法能很快建立起庞大的化学衍生物库，使得先导化合物的化学修饰进程得以大大加快.利用生物芯片技术还能对天然植物成分进行筛选和分析，这在中药的现代化发展中非常有用.生物芯片技术的介入及相关的微量液体分配技术［39］及各种检测技术的采用，将使新药的研究与开发在技术上有一个较大的突破［40］，从而加速新药筛选市场的开发，目前已有多家公司正在从事这类研究与开发工作.
研究展望
生物芯片技术是一项综合性的高新技术，它涉及生物、化学、医学、精密加工、光学、微电子技术，信息等领域，是一个学科交叉性很强的研究项目.虽然生物芯片的研究已有了巨大的发展，但一些相关技术如检测技术的发展制约了生物芯片技术的进一步发展.这是因为随着芯片集成度的提高，所用反应物量的减少，其产生的信号也越来越微弱，因而，对高精度检测器的要求迫在眉睫.此外，微加工技术、芯片的封装和保存等也是在生物芯片的研发中应注重的方面.经过近十多年的不懈努力，生物芯片技术已开始从不成熟逐步走向成熟，并已开始给生命科学研究的许多领域开始带来冲击甚至是革命.今年1月Nature Genetics出了一期关于微阵列芯片技术的增刊，全面介绍了该技术的发展状况及几个主要应用领域，如重复测序和突变检测、基因表达分析、新药开发、生物信息学、群体遗传学研究等.由此我们可以看出微阵列芯片技术的重要性.对于生物芯片而言，微阵列芯片才只是其中一种检测芯片，与其并级的还有其他多种具有不同功能的芯片.单是其中一种技术就有如此重大的影响力，对生物芯片技术来说，它所能带来的重大意义和深远影响将是不可估量的.目前从样品的制备、化学反应到检测这三部分的分部集成已实现，全集成已初见端倪.到21世纪生物芯片市场的销售将达百亿美元以上，所以现在世界各国的公司、研究机构都在积极地进行研究、申请专利、开发新产品，争取早日登陆市场.较早涉足该领域的以美国为首的英、加、荷、德、日等几个国家已经取得了令人眩目的成就.面对这样的情况，我国应及早投入一定的财力、人力和物力，争取在该领域中占有一席之地，避免出现在很多高技术产业中那样技术几乎全被外国人垄断的局面.争取在基因和蛋白质表达芯片，微缩芯片实验室和超高通量药物筛选等方面有自己独到的创新和作为.
芯片的封装类型介绍
芯片的封装类型主要有以下几种：
1．BGA 球栅阵列封装
2．CSP 芯片缩放式封装
3．COB 板上芯片贴装
4．COC 瓷质基板上芯片贴装
5．MCM 多芯片模型贴装
6．LCC 无引线片式载体
7．CFP 陶瓷扁平封装
8．PQFP 塑料四边引线封装
9．SOJ 塑料J形线封装
10．SOP 小外形外壳封装
11．TQFP 扁平簿片方形封装
12．TSOP 微型簿片式封装
13．CBGA 陶瓷焊球阵列封装
14．CPGA 陶瓷针栅阵列封装
15．CQFP 陶瓷四边引线扁平
16．CERDIP 陶瓷熔封双列
17．PBGA 塑料焊球阵列封装
18．SSOP 窄间距小外型塑封
19．WLCSP 晶圆片级芯片规模封装
20．FCOB 板上倒装片
如果把中央处理器CPU比喻为整个电脑系统的心脏，那么主板上的芯片组就是整个身体的躯干。对于主板而言，芯片组几乎决定了这块主板的功能，进而影响到整个电脑系统性能的发挥，芯片组是主板的灵魂。
是检测基因表达。但是将生物分子有序地放在芯片上检测生化标本的策略是具有广泛的应用领域，除了基因表达分析外，杂交为基础的分析已用于基因突变的检测、多态性分析、基因作图、进化研究和其它方面的应用，微阵列分析还可用于检测蛋白质与核酸、小分子物质及与其它蛋白质的结合，但这些领域的应用仍待发展。对基因组DNA进行杂交分析可以检测DNA编码区和非编码区单个碱基改变、确失和插入，DNA杂交分析还可用于对DNA进行定量，这对检测基因拷贝数和染色体的倍性是很重要的。
用于DNA分析的样品可从总基因组DNA或克隆片段中获得，通过酶的催化掺入带荧光的核苷酸，也可通过与荧光标记的引物配对进行PCR扩增获得荧光标记DNA样品，从DNA转录的RNA可用于检测克隆的DNA片段，RNA探针常从克隆的DNA中获得，利用RNA聚合酶掺入带荧光的核苷酸。
对RNA进行杂交分析可以检测样品中的基因是否表达，表达水平如何。在基因表达检测应用中，荧光标记的探针常常是通过反转录酶催化cDNA合成RNA，在这一过程中掺入荧光标记的核苷酸。用于检测基因表达的RNA探针还可通过RNA聚合酶线性扩增克隆的cDNA获得。在cDNA芯片的杂交实验中，杂交温度足以除DNA中的二级结构，完整的单链分子（300-3000nt）的混合物可以提供很强的杂交信号。对寡核苷酸芯片，杂交温度通常较低，强烈的杂交通常需要探针混合物中的分子降为较短的片段（50-100nt），用化学和酶学的方法可以改变核苷酸的大小。
不同于DNA和RNA分析，利用生物芯片进行蛋白质功能的研究仍有许多困难需要克服，其中一个难点就是由于许多蛋白质间的相互作用是发生在折叠的具有三维结构的多肽表面，不像核酸杂交反应只发生在线性序列间。芯片分析中对折叠蛋白质的需要仍难达到，有以下几个原因：第一，芯片制备中所用的方法必需仍能保持蛋白质灵敏的折叠性质，而芯片制备中所有的化学试剂、热处理、干燥等均将影响到芯片上蛋白质的性质；第二，折叠蛋白质间的相互作用对序列的依赖性更理强，序列依赖性使得反应动力学和分析定量复杂化；第三，高质量的荧光标记蛋白质探针的制备仍待进一步研究。这些原因加上其它的问题减慢了蛋白质芯片检测技术的研究。
自从1991年Fodor等人［1］提出DNA芯片的概念后，近年来以DNA芯片为代表的生物芯片技术［2～6］得到了迅猛发展，目前已有多种不同功用的芯片问世，而且，有的已经在生命科学研究中开始发挥重要作用.所谓的生物芯片即应用于生命科学和医学领域中作用类似于计算机芯片的器件.其加工制作采用了像集成电路制作过程中半导体光刻加工那样的缩微技术，将生命科学中许多不连续的过程如样品制备、化学反应和检测等步骤移植到芯片中并使其连续化和微型化，这与当年将数间房屋大小的分离元件计算机缩微到现在只有书本大小的笔记本计算机有异曲同工之效.这种基于微加工技术发展起来的生物芯片，可以把成千上万乃至几十万个生命信息集成在一个很小的芯片上，对基因、抗原和活体细胞等进行测试分析，用这些生物芯片所制作的各种不同用途的生化分析仪和传统仪器相比较具有体积小、重量轻、成本低、便于携带、防污染、分析过程自动化、分析速度快、所需样品和试剂少等诸多优点.目前生物芯片已不再局限于基因序列测定和功能分析这样的应用，新派生的一批技术包括：芯片免疫分析技术［7］、芯片核酸扩增技术［8～10］、芯片精虫选择和体外受精技术［11，12］，芯片细胞分析技术［13］和采用芯片作平台的高通量药物筛选技术［14］等.这类仪器的出现将为生命科学研究、疾病诊断和治疗、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品卫生监督、航空航天等领域带来一场革命.因此，美国总统克林顿在1998年1月的国情咨文演讲中指出：“在未来的12年内，基因芯片将为我们一生中的疾病预防指点迷津”.另外，美国商界权威刊物Fortune［15］对此作了如下阐述: “微处理器在本世纪使我们的经济结构发生了根本改变，给人类带来了巨大的财富，改变了我们的生活方式.然而，生物芯片给人类带来的影响可能会更大，它可能从根本上改变医学行为和我们的生活质量，从而改变世界的面貌”.由于生物芯片技术领域的飞速发展，美国科学促进协会于1998年底将生物芯片评为1998年的十大科技突破之一［16］.现在，生物芯片已被公认将会给下个世纪的生命科学和医学研究带来一场革命，并已成为各国学术界和工业界所瞩目并研究的一个热点.
生物芯片研究状况
本世纪50，60年代以来，微电子技术的迅猛发展使其相关领域也取得了长足的进展，出现了一些新的研究方向，如微机电系统、微光学器件、微分析系统等.这些技术在生物、化学和医学等领域也得到了较广泛的应用，各种生物传感器和微型分析仪器相继出现，如芯片毛细管电泳仪，气体传感器及用于观察单个神经元细胞生长情况的仪器等.1991年Affymax公司Fodor领导的小组对原位合成制备的DNA芯片作了首次报道［1］.他们利用光刻技术与光化学合成技术相结合制作了检测多肽和寡聚核苷酸的微阵列（microarray）芯片.用该方法制作的DNA芯片可用于药理基因组学研究与基因重复测序工作.这一突破性的进展使生物芯片技术在世界范围内开始得到重视.随着近些年来各种技术的进步，生物芯片的应用范围不断扩大，科学家们采用微电子工业及其他相关行业的各种微加工技术在硅、玻璃、塑料等基质上加工制作了各种生物芯片.美国依靠其强大的科技能力和经济实力，在该领域的研究开发中处于领先位置，先后已有几十家生物芯片公司成立，开发出了近20种生物芯片，部分已投入研究应用.在DNA芯片的研究过程中，很多公司都开发了具有自身特色的技术.最早涉足该领域的Affymetrix公司已开发了多种基因芯片，部分芯片已投入商业应用，如用于检测HIV基因与p53肿瘤基因突变的芯片，还有用于研究药物新陈代谢时基因变化的细胞色素p450芯片.Hyseq公司开发的薄膜测序芯片采用的方法不是在未知序列的DNA片段上做荧光标记，而是在已知序列的探针上做标记，每次用不同的探针去与未知序列的DNA片段杂交，通过检测荧光得知杂交的结果，最后利用计算机处理实验结果，组合出待测DNA片段的序列.Synteni公司（现已为Incyte Pharmaceutical并购）研究了一种用玻璃作载体的DNA芯片，利用两种不同的荧光标记物，可同时在芯片上检测正常的信使RNA与受疾病或药物影响后的信使RNA的表达情况.Nanogen公司采用电场以主动出击的方式来操纵芯片上的DNA片段进行杂交，使其系统的反应速度比一般的让DNA随机扩散寻找固化杂交探针的被动式检测更快，使检测时间可减少到几十或几百分之一.Clinical Micro Sensors（CMS）公司正在开发一种非荧光检测芯片，利用电信号来确定DNA杂交中有无失配的情况.除了上述公司外，美国一些著名大学如斯坦福大学、宾夕法尼亚大学、加利福尼亚大学伯克利分校、麻省理工学院、橡树岭国家实验室等一些大学和国家实验室也在进行生物芯片的研究.欧洲一些国家的公司和大学同样也已涉足该领域并取得了明显的成就，日本有几家公司报道了他们的研究结果.最近，我国的清华大学、复旦大学、东南大学、军事医学科学院和中国科学院等机构也开始了这方面的研究工作，如果各方面重视、组织得当、加大资金投入力度、重视知识产权的保护，相信不久的将来在该领域中我国也会占有一席之地.生物芯片的制备使用
芯片制备生物芯片的制备主要依赖于微细加工、自动化及化学合成技术。 根据不同的使用要求，可以采用微加工技术在芯片的基底材料上加工出各种微细结构，然后再施加必要的生物化学物质并进行表面处理。而更为简单的芯片制备如DNA芯片的制备，则是在基底上利用自动化或化学合成方法直接施加或合成必要的生物化学物质，对基底材料并不做任何微细加工。通常比较典型的DNA芯片制备方法有4种。 第1种是Affymetrix公司开发的光引导原位合成法.该方法是微加工技术中光刻工艺与光化学合成法相结合的产物［17］。第2种方法是Incyte Pharmaceutical公司采用的化学喷射法。该方法是将合成好的寡核苷酸探针定点喷射到芯片上并加以固定化来制作DNA芯片。第3种方法是斯坦福大学研制的接触式点涂法，在DNA芯片制备中通过高速精密机械手的精确移动让移液头与玻璃芯片接触而将DNA探针涂敷在芯片上［18］。第4种方法是通过使用4支分别装有A，T，G，C核苷的压电喷头在芯片上并行合成出DNA探针［19］。不管何种方法，目的都是希望能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置上。
核酸样品的制备
分离和纯化核酸样品并不是一件容易的工作，它包括了细胞分离、破胞、脱蛋白、提取DNA等多方面的工作.在细胞分离方法上较突出的有过滤分离（如宾夕法尼亚大学研究小组开发的横坝式过滤芯片［20］）和介电电泳分离（利用施加在芯片上的高频非均匀电场在不同的细胞内诱导出偶电极，导致细胞受不同的介电力作用，从而把它们从样品中分离出来［21，22］）等.
生化反应
因为目前所用检测仪器的灵敏度还不够高，因此从血液或活体组织中提取的DNA在标记和应用前都需要扩增复制.例如，在对一个肿瘤的活体解剖样品进行检测时，需要在几千个正常基因中找到一个异常的癌基因，很显然这需要对样品DNA进行必要和特有的复制才易于检测.芯片中的核酸扩增研究目前已有了很大的进展，在芯片中进行PCR获得成功的有宾夕法尼亚大学研究小组［23］、美国加州Lawrence Livermore国家实验室［24］、Perkin-Elmer公司［25］和伦敦帝国理工大学［26］.宾夕法尼亚大学研究小组所做的扩增反应是在硅-玻璃芯片中进行的，芯片的外部加热和冷却采用的是计算机控制的Peltier电热器.他们成功地在硅-玻璃芯片中完成了一系列不同的核酸扩增反应，例如RT-PCR，LCR，多重PCR和DOP-PCR.Lawrence Livermore国家实验室加工的硅芯片采用了芯片内置式薄膜多晶硅加热套，使其升降温的速度可以得到极大的提高.Perkin-Elmer公司的PCR反应则是在塑料芯片上完成的.伦敦帝国理工大学Manz领导的研究小组研制了一种样品可在不同温度的恒温区间内连续流动的PCR芯片.
普通的PCR有一定的不足之处，如难以实现多重扩增以及在PCR过程中存在竞争等.Mosaic Technologies公司的研究人员研究出了固相PCR系统，他们将两个引物固化在丙烯酰胺薄膜上，并让其与DNA模板和PCR试剂接触，这样便可在固相表面进行PCR反应.扩增时所合成的DNA会在引物间形成桥，从而避免了竞争问题.该系统目前还处于研究阶段.在核酸样品制备中另一个革新的方法是Lynx Therapeutics公司研究的大规模并行固相克隆，该方法可以同时在样品中克隆出成百上千个单独的DNA片段.
检测方法
目前，常用的芯片检测方法有芯片毛细管电泳分离检测和亲和结合分析.芯片毛细管电泳是1983年由Dupont公司的Pace开发出来的.随后，瑞士的Ciba Geigy公司和加拿大的Alberta大学合作利用玻璃芯片毛细管电泳完成了对寡核苷酸的分离［27］.首次用芯片毛细管阵列电泳检测DNA突变和对DNA进行测序工作的是由加利福尼亚大学伯克利分校Mathies领导的研究小组完成的［28］.通过在芯片上加上高压直流电，他们在近2 min的时间内便完成了从118～1 353 bp的多条DNA片段的快速分离.宾夕法尼亚大学Wilding的小组与Ramsey的小组一道用芯片毛细管电泳对芯片中通过多重扩增得到的用于Duchenne-Becker肌萎缩诊断的若干DNA片段进行分离也获得了成功［29］.其他用芯片毛细管电泳检测突变的外国公司和学术机构有Perkin-Elmer公司、Caliper Technologies公司、Aclara Biosciences公司和麻省理工学院等.
对DNA芯片而言，亲和结合分析主要是通过核酸之间的杂交结合来进行的.杂交的复杂程度取决于芯片上探针的长度和被测DNA片段的长度以及DNA二级结构的稳定度.利用杂交可进行杂交重复测序［30，31］、DNA突变检测［31，32］和基因表达分析［33］.杂交重复测序的过程是：将含有与探针序列互补的单链DNA与其他DNA的混合物置于芯片上，固化的探针就会通过与其序列互补的DNA片段杂交而将其从很复杂的混合样品中识别出来，通过使用带有计算机的荧光检测系统对芯片上检测出来的DNA样品所发出的荧光强弱及各探针的已知序列进行分析、对照和组合就可以得知样品DNA所含的碱基序列.1996年Science对应用芯片杂交技术进行杂交重复测序作了报道，Chee等人［30］在一块固化有135 000个寡聚核苷酸探针（每个探针长度为25个核苷）的硅芯片上对长度为16.6 kb的整个人线粒体DNA进行了序列测定.每组探针之间的间隔为35 μm，重复测序精度为99%；此外通过对11个非洲人个体样品斑点进行分析，他们发现在这些样品中的线粒体DNA中所存在的突变多态性达505个.用生物芯片从事杂交测序的美国公司现有Affymetrix和Hyseq两家，Affymetrix还开发了一套系统（gene chip bioinformation system），将芯片测序与生物信息学联系在一起，测序结果直接进入数据库做下一步的分析.利用杂交分析DNA的一个重要应用是进行DNA突变检测，例如Hacia等人［32］采用由96 000个寡核苷酸探针所组成的杂交芯片，完成了对遗传性乳腺癌和卵巢肿瘤基因BRCA1中外显子上的24个异合突变点(单核苷突变多态性)的检测.他们通过引入参照信号和被检测信号之间的色差分析使得杂交的特异性和检测灵敏度获得了提高.用生物芯片做杂交突变检测的美国公司有Beckman，Abbot Laboratory，Affymetrix，Nanogen，Sarnoff，Genometrix，Vysis，Hyseq，Molecular Dynamics等； 英美学术机构有宾夕法尼亚大学，牛津大学，Naval Research，Whitehead Institute for Biomedical Research，Argonne国家实验室等.利用芯片杂交对基因表达进行分析研究是DNA芯片的另一个主要用途.一般来说，对基因表达进行研究需要相对较长的杂交时间，不需要准确地测序，而主要是了解基因中独特的Motifs结构.基因表达的分析研究给疾病诊断和药物筛选带来了巨大的冲击.Lockhart等人［34］采用固化有65 000个不同序列探针（长度为20个核苷）的芯片，定量地分析了一个小鼠T细胞中整个RNA群体中21个各不相同的信使RNA，这些专门设计的探针能与114个已知的小鼠基因杂交.分析结果发现，在诱发细胞分裂后另外20个信使RNA的表达也发生了改变.检测结果表明该系统对RNA的检出率为1:300 000，对信使RNA的定量基准为1:300.DeRisi等人［35］将一个恶性肿瘤细胞线中得到的1 161个不同的cDNA探针通过机械手“刷印”到载玻片上以观察癌基因的表达情况.在比较两个标有不同荧光标记的细胞信使RNA群的杂交结果之后，他们对引入正常人染色体后肿瘤基因受到抑制的细胞中的基因表达结果进行了分析.微阵列芯片不仅在基因分析上获得成功，研究人员更是将该技术与其他相关领域相结合，使得微阵列技术的应用更加广泛［36，37］.
对基因芯片的制作者和用户来说，在芯片上从事杂交目前所获得的结果并不是很完美的，存在着一些问题.首先，阵列上的杂交不是一个简单的液相反应，而是液-固反应，使得DNA链并不能在完全游离的情况下自然地杂交结合在一起；而且DNA的二级结构也会导致失真的杂交结果（链内杂交问题）.针对后一个问题，人们又研究出通过使用peptide nucleic acids（PNA）探针来解决链内杂交问题的新方案.在PNA-DNA杂交过程中，用PNA制作的探针比用DNA作的探针更容易接近DNA的目标序列.相比之下，PNA-DNA杂交结构比DNA-DNA杂交结构更稳定，所以对错配也就更易检测.让DNA在芯片表面富集是提高在芯片上DNA并行杂交速度的一个措施之一.Nanogen公司所开发的主动式电子生物芯片，可以使被检测的DNA/RNA分子以很快的速度接近被固化的DNA探针，从而使杂交速度得到极大的提高.
信息采集
目前，大多数的DNA芯片分析采用的是荧光检测.荧光检测重复性好，是目前研究人员广泛使用的一种方法.除此之外，还有飞行时间质谱仪、光波导、二极管阵列检测、直接电量变化检测等.例如，美国Sequenom公司采用光敏连接技术，将探针通过光敏基团连接在芯片上.当杂交结束后，利用激光切割释放寡聚核苷酸并用飞行时间质谱仪进行检测.该公司现在只能对较短的DNA片段进行分析，最终是否能实现对长序列DNA做分析还有待进一步努力.威斯康星大学的Smith等人最近也用PNA探针和飞行时间质谱仪分析了人体内酪氨酸酶基因的多态位点.不管是何种检测系统，都需要利用一些必要的仪器与软件，如扫描共聚焦显微镜可以在微米级的分辨率下检测芯片表面数以千计的探针杂交结果，很多公司也为芯片的分析开发了相应的软件，以便快速地对杂交数据进行处理和分析.除了上述通过杂交获得分析结果的微小阵列芯片以外，还有其他多种具有不同微结构（如微通道、反应腔、过滤器等等）的芯片正在研制和开发中，这些芯片的大小一般为1 cm2.生物芯片的研究在80年代就已开始，如杜邦公司研究的芯片毛细管电泳技术.目前，已开发的生物芯片种类越来越多，如毛细管电泳芯片、细胞分离芯片、免疫芯片、质谱分析芯片、核酸扩增芯片等，所有这些芯片的研究与开发为以后分析仪器的微型化和缩微芯片实验室的实现打下了良好的基础.
生物芯片的发展方向
与微加工技术朝纳米尺度发展一样，某些种类的生物芯片的研究也正在朝向纳米量级发展.研究人员发现一些天然分子或分子的生物自组装能力完全可以用于制作纳米器件.例如，用胶原质做导线，抗体做夹子，DNA做存储器，膜蛋白做泵等等.虽然目前尚无成功的纳米芯片出现.人们利用分子的自组装特性制作了一些结构，如直径为0.5 μm、长30 μm的脂质管；直径0.7 μm的圆形多肽纳米管和显微分子齿轮等.这些利用分子来设计和装配仪器零件类似物的研究，为纳米芯片的开发打下了良好的基础.
对生物芯片研究人员来说，最终的研究目标是对分析的全过程实现全集成，即制造微型全分析系统（micro total analytical systems）或缩微芯片实验室（laboratory-on-a-chip）.在芯片的功能集成方面，目前已有了一批成果.首先，美国Nanogen公司、Affymetrix公司、宾夕法尼亚大学医学院和密西根大学的科学家们通过利用在芯片上制作出的加热器、阀门、泵、微量分析器、电化学检测器或光电子学检测器等，将样品制备、化学反应和检测3部分作了部分集成，并在此基础上先后制作出了结构不同的缩微芯片实验室样机［38］.例如，Nanogen公司的科学家采用生物电子芯片在较短时间内先通过施加高频交流电场把微生物从人的血样中分离出来，然后用电脉冲进行破胞处理，最后对破胞后所得的脱氧核糖核酸进行片段化和杂交检测.该实验的成功是生物芯片研究领域的一大突破，它向人们展示了用生物芯片制作缩微实验室的可能性.
生物芯片技术另外一个重要、且具有很强应用价值的发展方向就是为新药的开发提供高通量乃至超高通量筛选的技术平台［14］.该项技术是将生物芯片技术所具有的高集成度与组合化学技术、受体结合分析及机器人自动化技术等相结合而产生的.组合化学是利用高分子载体快速同步合成先导物的类似物和衍生物的一种化学方法，它使过去的衍生物个体化合成方式发展成以串联和并联方式同步合成数以千计乃至数万个化合物的组合合成方式.反应后先对混合物进行分组筛选，然后根据生物活性再决定是否对个别化合物进行分离纯化.这种根据母体化合物结构快速合成化合物群体，其结构范围又可以预测的方法能很快建立起庞大的化学衍生物库，使得先导化合物的化学修饰进程得以大大加快.利用生物芯片技术还能对天然植物成分进行筛选和分析，这在中药的现代化发展中非常有用.生物芯片技术的介入及相关的微量液体分配技术［39］及各种检测技术的采用，将使新药的研究与开发在技术上有一个较大的突破［40］，从而加速新药筛选市场的开发，目前已有多家公司正在从事这类研究与开发工作.
研究展望
生物芯片技术是一项综合性的高新技术，它涉及生物、化学、医学、精密加工、光学、微电子技术，信息等领域，是一个学科交叉性很强的研究项目.虽然生物芯片的研究已有了巨大的发展，但一些相关技术如检测技术的发展制约了生物芯片技术的进一步发展.这是因为随着芯片集成度的提高，所用反应物量的减少，其产生的信号也越来越微弱，因而，对高精度检测器的要求迫在眉睫.此外，微加工技术、芯片的封装和保存等也是在生物芯片的研发中应注重的方面.经过近十多年的不懈努力，生物芯片技术已开始从不成熟逐步走向成熟，并已开始给生命科学研究的许多领域开始带来冲击甚至是革命.今年1月Nature Genetics出了一期关于微阵列芯片技术的增刊，全面介绍了该技术的发展状况及几个主要应用领域，如重复测序和突变检测、基因表达分析、新药开发、生物信息学、群体遗传学研究等.由此我们可以看出微阵列芯片技术的重要性.对于生物芯片而言，微阵列芯片才只是其中一种检测芯片，与其并级的还有其他多种具有不同功能的芯片.单是其中一种技术就有如此重大的影响力，对生物芯片技术来说，它所能带来的重大意义和深远影响将是不可估量的.目前从样品的制备、化学反应到检测这三部分的分部集成已实现，全集成已初见端倪.到21世纪生物芯片市场的销售将达百亿美元以上，所以现在世界各国的公司、研究机构都在积极地进行研究、申请专利、开发新产品，争取早日登陆市场.较早涉足该领域的以美国为首的英、加、荷、德、日等几个国家已经取得了令人眩目的成就.面对这样的情况，我国应及早投入一定的财力、人力和物力，争取在该领域中占有一席之地，避免出现在很多高技术产业中那样技术几乎全被外国人垄断的局面.争取在基因和蛋白质表达芯片，微缩芯片实验室和超高通量药物筛选等方面有自己独到的创新和作为.
芯片的封装类型介绍
芯片的封装类型主要有以下几种：
1．BGA 球栅阵列封装
2．CSP 芯片缩放式封装
3．COB 板上芯片贴装
4．COC 瓷质基板上芯片贴装
5．MCM 多芯片模型贴装
6．LCC 无引线片式载体
7．CFP 陶瓷扁平封装
8．PQFP 塑料四边引线封装
9．SOJ 塑料J形线封装
10．SOP 小外形外壳封装
11．TQFP 扁平簿片方形封装
12．TSOP 微型簿片式封装
13．CBGA 陶瓷焊球阵列封装
14．CPGA 陶瓷针栅阵列封装
15．CQFP 陶瓷四边引线扁平
16．CERDIP 陶瓷熔封双列
17．PBGA 塑料焊球阵列封装
18．SSOP 窄间距小外型塑封
19．WLCSP 晶圆片级芯片规模封装
20．FCOB 板上倒装片
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